生物膜是由附著于惰性或者活性固體資料名義的微生物跟由微生物自身分泌的胞外聚合物所形成的高度結(jié)構(gòu)化微生物群落.它的存在可引起一系列的環(huán)境問題, 如膜沾染、管道堵塞、金屬名義腐化跟消毒效力降落等.目前對其把持多采取殺菌劑、抗菌劑或其它大分子抑菌劑.但這些物質(zhì)的開釋無疑帶來了新的環(huán)境危險, 長期利用抗生素或者殺菌劑還會導(dǎo)致細菌的抗藥性增加, 耐藥細菌蔓延.
利用化學(xué)信號小分子物質(zhì)通過克制微生物活性, 調(diào)節(jié)生物膜的發(fā)展進程是目前生物膜范疇的研究熱點.雙胺是某些微生物自身產(chǎn)生的可能引起一些生物膜瓦解的信號分子, 探討這種小分子物質(zhì)的生物膜調(diào)控作用對開發(fā)新興生物膜把持技巧存在重要意思.目前, 雙胺對微生物附著的克制研究較少且多集中于純菌生物膜, 對混淆菌落生物膜的克制研究鮮有報道.實際環(huán)境中的生物膜多由混淆菌群組成, 因此有必要研究雙胺對混淆菌落生物膜克制及解聚效應(yīng).本研究將以雙胺為目標(biāo)物質(zhì), 考察這種小分子物質(zhì)對混淆菌落生物膜形成克制及瓦解效應(yīng)機制, 并進一步對其減緩膜名義生物沾染的可行性進行探討.該研究對樹破基于小分子物質(zhì)的生物膜克制及膜名義生物沾染把持方法存在實際價值與實際領(lǐng)導(dǎo)意思.
2 資料與方法2.1 化學(xué)試劑跟微生物
雙胺購自美國Sigma-Aldrich公司, 純度為99%.其余化學(xué)試劑購于夢怡美生物科技有限公司.
混淆菌落來源于清河污水處理廠的活性污泥, 經(jīng)過上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司通過MiSeq體系剖析組成重要包含叢毛單胞菌屬、孢魚菌科、腸桿菌科、梭狀芽孢桿菌、鞘脂單胞菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、寡養(yǎng)單胞菌跟鐵桿菌屬.活性污泥首先用磷酸鹽緩沖溶液沖刷3遍以去除污泥溶液中的EPS及有機物, 而后將活性污泥重懸于合成廢水中用于制備混淆菌菌懸液.合成廢水包含：COD 825;NH4Cl 192;KH2PO4 35.1;NaCl 100;MgSO4 100;CaCl2 10;pH=6.5~7.5.
2.2 雙胺對混淆菌群生物膜形成影響研究
將含有不同濃度雙胺的菌懸液加入到聚苯乙烯的12孔板中, 每孔4 mL, 雙胺終濃度分辨為0、2.62、6.55、13.10、26.20、65.50或131 mg·L-1, 每個濃度設(shè)置6個平行樣以確保實驗的正確性.將加完樣品的12孔板置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中分辨靜止培養(yǎng)12 h跟24 h.培養(yǎng)實現(xiàn)后附著的生物膜量利用結(jié)晶紫染色法絕對定量.本研究以活性污泥作為生物膜形成的混淆菌來源, 隨著生物膜的形成跟發(fā)展, 其群落結(jié)構(gòu)可能會與活性污泥有一些差別, 但本研究重點不是關(guān)注其群落結(jié)構(gòu)演變進程, 而是以生物膜情勢負載到基底資料名義生物量的變更, 并以其來評估生物膜形成克制效應(yīng).
2.3 不同基底層上雙胺對混淆菌群附著影響
克制劑對微生物附著特點的影響跟附著基底資料名義特點密切相干, 所以本研究進一步考察了雙胺對微生物在不同材質(zhì)基底層名義的附著影響.分辨抉擇存在不同親疏水性特點的聚苯乙烯、玻璃片跟聚甲基丙烯酸甲酯3種資料為附著界面, 3種名義接觸角分辨為93.4°、22.0°跟81.9°.分辨將20 mm× 20 mm玻璃片或聚甲基丙烯酸甲酯片置于6孔板中進行附著實驗, 每個孔板中加入6 mL污泥懸液, 再分辨加入雙胺終濃度為0或131 mg·L-1.污泥懸液、基質(zhì)濃度及操作前提跟上述的附著實驗一致.培養(yǎng)24 h后, 將載玻片烘干, 染色并用Olympus相機進行拍照記錄.
2.4 雙胺對膜沾染緩解效應(yīng)研究
將雙胺投加到溶液通過跟懸浮微生物作用之后, 微生物在膜名義的附著實驗分辨以靜態(tài)附著跟動態(tài)逝世端過濾情勢考察.靜態(tài)實驗如下：將直徑為3.5 cm的膜片置于6孔培養(yǎng)板, 加入10 mL混淆菌液, 同時加入雙胺使其終濃度分辨為0或131 mg·L-1, 30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24 h, 取出膜片放在15 mL PBS中超聲使附著的微生物完全脫落伍在旋渦混淆器中疾速混淆15 s, 測定細菌OD600值.動態(tài)過濾采取恒流過濾模式, 利用一臺蠕動泵將儲水容器中混淆菌液通過管道壓入膜組件, 電子天平收集溶液的品質(zhì)數(shù)據(jù), 當(dāng)膜名義造成一定堵塞之后, 膜壓增加, 壓力表讀數(shù)回升.通過壓力表讀數(shù)可間接評估膜沾染發(fā)展?fàn)顩r.
2.5 雙胺對混淆菌群生物膜瓦解影響研究
為了考察雙胺對生物膜的瓦解機能, 需預(yù)先培攝生物膜.而后將載玻片拿出洗掉未附著的微生物.而后放置于含有131 mg·L-1雙胺的PBS溶液中, 另外的載玻片放入只含有PBS的溶液中作為對比, 30 ℃分辨靜置6、8、10或12 h后, 將載玻片拿出洗掉懸浮的微生物, 殘余生物量采取如上結(jié)晶紫染色法進行絕對定量.
2.6 雙胺對懸浮微生物EPS散布影響研究
為了探討雙胺對生物膜形成克制機理, 本研究進一步對懸浮混淆菌群微生物的EPS進行考察.具體操作步驟如下：將含有一定濃度的污泥懸液跟基質(zhì)置于50 mL離心管中, 同時加入雙胺使其終極濃度分辨為0、131 mg·mL-1, 30 ℃放置一定時光, 測定EPS含量變更, 同時測定懸浮液的OD600變更.EPS的提取參考Xuan等的方法, 蛋白測定采取的Lowry法, 多糖的測定采取的是硫酸-苯酚比色法;eDNA的測定參考Allesen-Holm等的方法.
3 結(jié)果與探討3.1 雙對混淆菌群生物膜形成影響
不同濃度雙胺對混淆菌群微生物附著特點的影響結(jié)果如所示.微生物經(jīng)2.62~131 mg·L-1雙胺處理12 h附著量降落了5.61%~67.93%, 處理24 h附著量降落了4.60%~74.61%.可見在選定的兩個時光段對微生物附著的克制造用均隨著雙胺濃度升高而加強.
不同濃度雙胺對混淆菌落生物膜形成影響
3.2 不同基底層上雙胺對微生物附著影響
微生物附著到載體名義是生物膜形成的第一步, 可能通過特異性或者非特異性的細菌-名義彼此作用產(chǎn)生.一些名義特點會影響微生物的附著, 且一些克制劑對微生物附著克制造用也會受到名義特點的影響.因此, 本研究對不同基底層上雙胺對微生物附著影響特點進行考察.雙胺存在的情況下, 附著到基底資料的生物量經(jīng)結(jié)晶紫染色記錄, 如所示.結(jié)果顯示無論是在疏水性的聚苯乙烯名義還是親水性的聚甲基丙烯酸甲酯跟玻璃名義, 雙胺對微生物的附著均有很好地克制造用.說明這種物質(zhì)可能普遍利用于不同材質(zhì)資料名義生物膜的把持.
不同基底層名義雙胺對微生物附著影響
3.3 雙胺對膜沾染緩解效應(yīng)研究
另外, 為了進一步探討雙胺把持膜名義生物沾染的可能性, 將雙胺投加到溶液通過跟懸浮微生物作用之后, 考察微生物在膜名義的附著狀況, 分辨以靜態(tài)附著跟動態(tài)過濾情勢考察.靜態(tài)情勢培養(yǎng)前提下, 微生物經(jīng)過不同濃度的雙胺作用后在聚酰胺膜名義的附著量如所示.結(jié)果顯示, 微生物經(jīng)過雙胺處理在膜名義的附著量明顯降落, 而且雙胺濃度越高, 附著量越少.例如, 經(jīng)過26.2、65.5及131.0 mg·L-1雙胺處理后, 微生物在膜名義附著量分辨降落了18.38%、31.03%跟69.15%.雙胺明顯克制了微生物在膜名義的附著, 而且這種克制后果跟雙胺濃度成正相干.此結(jié)果也在SEM中得到證明, 對比組膜名義形成的微生物群落比較致密, 生物膜連成片, 而實驗組膜名義附著的微生物相稱稀少, 有大量的空白區(qū)域, 實驗組膜名義附著的生物量要明顯少于對比組膜名義附著的微生物量.
雙胺對混淆菌落微生物在聚酰胺膜名義的附著影響
對生物膜動態(tài)過濾培養(yǎng)進程, 膜過濾進程中膜壓隨過濾液品質(zhì)及時光變更如所示.由圖可能看出, 當(dāng)過濾分量為359.71 g, 過濾時光170 min時, 對比組膜孔產(chǎn)生了一定水平的堵塞, 此時膜壓為10 kPa, 但實驗組中的膜壓仍然為0, 表明膜孔徑并不像對比組膜堵塞重大;當(dāng)過濾液品質(zhì)為628.55 g, 過濾時光為300 min時, 實驗組中的膜壓力開端回升, 膜壓為12.5 kPa, 約為過濾時光175 min時的對比組膜壓, 而此時對比組中的膜壓已經(jīng)為50 kPa.這表明雙胺可減緩膜過濾進程中膜孔堵塞速度, 降落膜壓, 緩解由微生物引起的膜沾染問題.具體接洽污水寶或參見http://www.dowater.com更多相干技巧文檔
膜過濾進程膜壓隨過濾品質(zhì)跟過濾時光變更圖
3.4 雙胺對混淆菌群生物膜瓦解影響
一些傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法, 如沖刷、消毒劑及紫外線消毒等常被用作生物膜去除, 但因為生物膜中細菌受EPS的維護作用使其對這些通例方法存在一定抗性, 即便高濃度的殺菌劑也很難將生物膜去除.例如, 500 mg·L-1的通例剝離劑也難以剝離成熟的生物膜, 紫外線對生物膜中微生物殺滅才干明顯弱于對懸浮微生物的殺滅作用.本研究進一步對小分子物質(zhì)雙胺是否引起成熟生物膜瓦解進行探討.131.0 mg·L-1雙胺對預(yù)培養(yǎng)12 h的生物膜瓦解后果如所示.由圖得出, 雙胺處理生物膜6~12 h后, 生物膜量絕對對比組降落了3.87%~23.59%, 由此可能說明雙胺對生物膜瓦解有一定的增進作用.這對把持生物膜, 降落微生物保險危險存在重要的意思.
雙胺對成熟生物膜的瓦解作用
3.5 雙胺對微生物EPS分泌的影響
為了進一步摸索雙胺對微生物的作用機制, 本研究進一步考察了雙胺對微生物成長及其EPS的影響.結(jié)果如所示, 131 mg·L-1雙胺對微生物12 h成長量的克制率為0.36%±0.54%, 不克制微生物成長;對比組中胞外蛋白、多糖跟eDNA的含量分辨是 mg·g-1 MLVS
S、 mg·g-1 MLVSS跟 μg·g-1 MLVSS, 經(jīng)過雙胺處理之后, 胞外多糖跟eDNA均有降落, 分辨為 mg·g-1 MLVSS, μg·g-1 MLVSS, 降落了39.37%±2.68%跟70.05%±2.93%, 而胞外蛋白含量多少乎不變更, 均堅持在8.02~8.98 mg·g-1 MLVSS.本課題組進一步通過激光共聚焦察看及定量盤算顯示雙胺對生物膜處理后使多糖減少了53%.由此可能推斷雙胺對微生物附著及生物膜形成的克制造用并不是通過殺菌產(chǎn)生, 對微生物EPS中胞外多糖跟eDNA分泌有一定的克制造用, 但對胞外蛋白不影響.
雙胺對微生物成長及EPS產(chǎn)量的影響
據(jù)報道, 雙胺結(jié)構(gòu)中含有的氨基可能直接跟一些帶負電荷的基團或者是胞外多糖中一些帶有極性基團的糖類彼此作用, 這可能是其引起二者濃度降落的重要起因.家喻戶曉, EPS對微生物附著及其生物膜形成起著至關(guān)重要的作用, 它促使微生物在生物跟非生物名義的初始附著.將EPS完全去除當(dāng)前, 微生物的附著機能明顯降落.胞外多糖是生物膜形成的引誘因子, 可使名義預(yù)處理化附著更輕易產(chǎn)生, 甚至可能作為細菌碳源;eDNA對微生物在親水性跟疏水性名義的附著都起著重要的作用, 它通過多種方法調(diào)控生物膜的發(fā)展進程, 如為其余細菌供給基質(zhì)、它是生物膜結(jié)構(gòu)的重要成分、可增進基因物質(zhì)的交換及調(diào)控結(jié)合性攝取體系等.另外, EPS中的蛋白組大多為帶正電荷的疏水性物質(zhì)、多糖為帶負電荷的親水性物質(zhì)及eDNA為帶負電荷的疏水性物質(zhì), 三者之間的彼此作用堅持了細菌的名義特點, 當(dāng)這三者組成產(chǎn)生變更時會造成細菌名義特點的變更, 而細菌名義特點跟微生物的附著密切相干.所以本研究中雙胺通過克制微生物中EPS某些成分的特點或者分泌, 進而影響微生物附著跟生物膜形成, 并且導(dǎo)致一小局部的生物膜可能從EPS的包裹中開釋出來瓦解為懸浮態(tài)細菌, 即引起生物膜瓦解.已有一些報道也發(fā)明當(dāng)EPS中蛋白、多糖跟eDNA濃度降落時, 微生物附著量相應(yīng)降落.
4 論斷
1) 雙胺能有效克制混淆菌群微生物附著跟生物膜形成, 隨著濃度的升高克制造用加強, 且其克制后果較為牢固, 克制率不會隨著時光延長而降落.
2) 雙胺對成熟生物膜瓦解有一定的增進作用.這對把持生物膜, 降落微生物保險危險存在重要的意思.
3) 雙胺在生物膜形成有效克制濃度范疇內(nèi)并錯誤于微生物成長產(chǎn)生明顯作用, 因此不是通過殺菌方法克制生物膜形成, 而是通過克制微生物中EPS含量, 可能避免傳統(tǒng)殺菌劑產(chǎn)生的抗藥性問題, 因此為生物膜克制供給了新方法.
4) 雙胺可減緩膜過濾進程中膜孔堵塞速度, 降落膜壓, 緩解由微生物引起的膜沾染問題, 這對環(huán)境中膜沾染把持存在潛在的領(lǐng)導(dǎo)意思.
